ایمونواسی روش هایی برای تشخیص و تعیین کمیت آنالیت ها در یک نمونه بیولوژیکی بر اساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی خاص است. آنها به طور گسترده ای در تحقیقات علمی و کشف داروهای دارویی برای دهه ها مورد استفاده قرار گرفته اند و تا زمانی که آنتی بادی های شناخته شده ای وجود داشته باشند که به طور خاص به آن هدف متصل می شوند، می توانند برای شناسایی اهداف مختلف از جمله پروتئین ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک استفاده شوند.
ایمونواسی های سنتی شامل پروتکل های پرزحمت و وقت گیر است که به چندین مرحله شستشو و جوجه کشی نیاز دارد. با این حال، پیشرفت‌ها در فناوری‌های تشخیص جدید منجر به توسعه سریعتر ایمونواسی‌های بدون شستشو شده است. در این مقاله، محدودیت‌های کیت‌های ایمونواسی رایج تجاری در دسترس را با مزایای جایگزین‌های جدید بدون شستشو بررسی می‌کنیم و در مورد پنج سؤال کلیدی که باید هنگام انتخاب روش ایمنی مناسب برای تحقیق خود در نظر بگیرید، بحث می‌کنیم.
انواع رایج ایمونواسی
سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)
ELISA سنجشی برای تشخیص آنتی ژن های هدف خاص با تثبیت آنها بر روی یک سطح جامد، مانند صفحه پلی استایرن 96 یا 384 چاهی است. روش های مختلف الایزا وجود دارد، اما همه آنها شامل مراحل زیر است:
- پوشش: اتصال یک آنتی ژن/آنتی بادی خاص به یک سطح جامد
- کاوشگری: جوجه کشی آنتی ژن با آنتی بادی اولیه اختصاصی آنتی ژن
- شستشو: حذف آنتی ژن و آنتی بادی آزاد غیر متصل
- کشف: اندازه گیری سیگنال تولید شده توسط یک آنتی بادی اولیه یا ثانویه نشاندار شده با آنزیم
- ELISA مستقیم
در ELISA های مستقیم، آنتی ژن مستقیماً به سطح صفحه متصل می شود و تنها با یک آنتی بادی اولیه که با برچسب تشخیص برچسب گذاری شده است، انکوبه می شود. سیگنال مستقیماً توسط آنتی بادی اولیه تولید می شود.
- فواید: مراحل کمتر؛ سریعتر
- محدودیت ها: کمتر خاص؛ پس زمینه بالا؛ بدون افزایش سیگنال
- ELISA غیر مستقیم
در ELISA غیرمستقیم، آنتی ژن مستقیماً به سطح صفحه متصل می شود. با این حال، بر خلاف ELISA های مستقیم، تشخیص نیاز به انکوباسیون با آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه دارد. سیگنال توسط آنتی بادی ثانویه کونژوگه شده با برچسب تشخیص تولید می شود.
- فواید: تقویت سیگنال را فعال می کند
- محدودیت ها: مراحل بیشتر؛ واکنش متقابل بالقوه از آنتی بادی ثانویه
- ساندویچ الایزا
ساندویچ الایزا به دو آنتی بادی اولیه علیه اپی توپ های مختلف آنتی ژن هدف نیاز دارد. یکی از آنتی بادی های اولیه روی سطح صفحه بی حرکت می شود و آنتی ژن هدف را می گیرد. سپس یک آنتی بادی اولیه دوم نیز به آنتی ژن هدف متصل می شود و یک کمپلکس ساندویچی را تشکیل می دهد. سیگنال توسط دومین آنتی بادی اولیه با برچسب تشخیص تولید می شود.
آزمایش های الایزا ساندویچ سنتی نیاز به چندین مرحله شستشو دارند. با این حال، برخی از کیت های تجاری جدیدتر “Fast ELISA” به مجموعه ساندویچ آنتی بادی-آنتی ژن اجازه می دهد تا در یک مرحله تشکیل شود، بنابراین تنها به یک مرحله شستشو نیاز دارد. عیب این کیت‌های الایزا سریع این است که نیاز به خرید صفحاتی دارند که از قبل با آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده به برچسب‌های میل ترکیبی خاص پوشانده شده‌اند.
- فواید: ویژگی بالا؛ حساسیت بالا
- محدودیت ها: یافتن جفت آنتی بادی منطبق دشوار است
- الایزای رقابتی
ELISA های رقابتی مبتنی بر اتصال رقابتی هستند: یک آنتی ژن یا آنتی بادی مرجع با یک آنتی ژن یا آنتی بادی نمونه نشاندار نشده برای همان محل اتصال رقابت می کند. همه ELISAهایی که در بالا مورد بحث قرار گرفت می توانند با یک فرمت رقابتی سازگار شوند. در یک مثال، یک آنتی ژن مرجع از قبل روی سطح صفحه پوشانده شده است، پس از آن یک آنتی ژن نمونه مخلوط با یک آنتی بادی نشاندار اضافه می شود. در طول انکوباسیون، نمونه و آنتی ژن مرجع برای اتصال به آنتی بادی نشاندار شده با هم رقابت می کنند. هرچه غلظت آنتی ژن در نمونه بیشتر باشد، آنتی بادی های نشاندار کمتری به آنتی ژن مرجع متصل می شوند و سیگنال تشخیص کمتر می شود.
- فواید: انعطاف در فرم؛ حساسیت کمتری نسبت به رقت نمونه و ماتریس نمونه؛ می توانید از نمونه خام استفاده کنید (بدون نیاز به خالص سازی آنتی ژن)
- محدودیت ها: بستگی به فرم داره
رادیوایمونواسی (RIA)
رادیوایمونواسی از ایزوتوپ های رادیواکتیو به عنوان نشانگر تشخیص استفاده می کند. این سنجش ها بر اساس اتصال رقابتی هستند. ابتدا، یک آنتی ژن نشاندار شده رادیواکتیو (که “برچسب” نامیده می شود) با یک آنتی بادی مخلوط می شود تا کمپلکس های آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل شود. سپس یک نمونه حاوی آنتی ژن بدون برچسب اضافه می شود. آنتی ژن بدون برچسب برای همان محل های اتصال آنتی بادی برای جابجایی برچسب (“برچسب رایگان”) رقابت می کند. سیگنال رادیواکتیو برچسب آزاد و برچسب متصل به آنتی بادی برای اندازه گیری غلظت آنتی ژن نشاندار نشده در نمونه استفاده می شود. برچسب محدود کمتر و برچسب آزاد بیشتر به معنای غلظت آنتی ژن بالاتر است.
- فواید: حساسیت بالا
- محدودیت ها: خطر ایمنی به دلیل خطر قرار گرفتن در معرض تشعشع؛ دفع زباله های رادیواکتیو
سنجش های ایمونولوژیکی مبتنی بر FRET
ایمونواسی انتقال انرژی تشدید فلورسانس (FRET) بر اساس انتقال انرژی بین یک فلوروفور دهنده و یک فلوروفور گیرنده است. فلوروفورها با آنتی بادی هایی ترکیب می شوند که با اتصال به آنالیت هدف نزدیک تر می شوند. فلوروفور دهنده باید توسط یک منبع انرژی مانند لامپ یا لیزر تحریک شود که به تجهیزات تخصصی نیاز دارد. فلورسانس دهنده و گیرنده هر دو اندازه گیری می شوند و نتایج به صورت نسبتی از دو سیگنال تولید می شوند. انواع روش‌های ایمونواسی مبتنی بر FRET شامل فلورسانس با زمان حل‌وفصل (TR-FRET) و HTRF® (فلورسانس همگن با تفکیک زمانی) است که از یک مولکول دهنده جایگزین برای کاهش سیگنال پس‌زمینه و افزایش پایداری سیگنال استفاده می‌کند.
- فواید: فرمت سنجش همگن قابل مقیاس بندی تا قالب 384 چاه
- محدودیت ها: نیاز به ابزار تخصصی؛ باید در محیط کم نور انجام شود
ایمونواسی Lumit™
ایمونواسی Lumit™ مبتنی بر NanoBiT هستند® فناوری – یک سیستم مکمل پروتئین که از دو زیر واحد آنزیم لوسیفراز مهندسی شده استفاده می کند: کوچک (SmBiT) و بزرگ (LgBiT). این دو زیر واحد تمایل کمی به یکدیگر دارند و فقط می توانند نانولوک فعال را تشکیل دهند® لوسیفراز در مجاورت نزدیک. برای تشخیص یک آنتی ژن خاص، آنتی بادی ها با LgBiT و SmBiT برچسب گذاری شده و با نمونه مخلوط می شوند. همانطور که آنتی بادی ها به آنتی ژن متصل می شوند، LgBiT و SmBiT به هم نزدیک تر می شوند تا یک نانولوک کاربردی تشکیل دهند.® لوسیفراز یک بستر حاوی یک معرف تشخیص برای تولید یک سیگنال فلورسنت که متناسب با سطوح آنتی ژن هدف است، اضافه می شود. پروتکل ساده add-mix-read نیازی به مراحل شستشو ندارد و تنها در 30 تا 90 دقیقه تکمیل می شود. همه چیز در یک چاه انجام می شود و امکان اندازه گیری مستقیم آنالیت را در صفحه کشت سلولی یا روی محیط های حذف شده از سلول ها فراهم می کند و آنها را برای کاربردهای با توان بالا ایده آل می کند.
- فواید: سریع؛ بدون مراحل شستشو؛ حساسیت بالا؛ طیف گسترده ای پویا؛ نیازی به صفحات از پیش روکش شده یا ابزار تخصصی ندارد
- محدودیت ها: همه سنجش ها با نمونه های سرم سازگار نیستند
ملاحظات برای انتخاب ایمونواسی
با تمام گزینه های موجود، انتخاب ایمونواسی مناسب برای هدف شما می تواند کار دشواری باشد. در زیر سؤالاتی وجود دارد که باید هنگام انتخاب یک روش ایمونواسی مورد توجه قرار گیرند:
-
به چه ابزارهایی دسترسی دارید؟
بسیاری از کیت های ایمونواسی تجاری به ابزارهای تخصصی برای تشخیص و شستشوی پلاک ها نیاز دارند که می تواند گران باشد. اگر آزمایشگاه شما بودجه کمی دارد و به این ابزارها دسترسی ندارد، این کیت ها ممکن است بهترین انتخاب نباشند. در این مورد، ممکن است بخواهید ایمونواسی را انتخاب کنید که می تواند از تشخیص فلورسنت یا لومینسنت استفاده کند، زیرا آنها فقط به صفحه خوان استاندارد برای تشخیص نیاز دارند.
-
چند نمونه دارید؟
اگر به طور معمول صدها یا هزاران نمونه را پردازش می کنید، مهم است که یک سنجش ایمنی پیدا کنید که بتواند نیازهای شما را برآورده کند. برخی از سنجش ها به فرمت های 96 چاهی محدود می شوند، در حالی که برخی دیگر با صفحات 1536 چاهی سازگار هستند.
-
نوع نمونه شما چیست؟
بیشتر ایمونواسی ها را می توان با نمونه های کشت سلولی استفاده کرد. اگر نمونه های دیگری مانند خون یا سرم را آزمایش می کنید، مهم است که یک ایمونواسی را انتخاب کنید که با نوع نمونه خاص شما سازگار باشد.
-
چقدر سریع نتیجه می خواهید؟
زمان مورد نیاز برای انجام یک ایمونواسی می‌تواند به‌طور چشمگیری متفاوت باشد – برخی نیاز به انکوباسیون یک شبه دارند، در حالی که برخی از سنجش‌ها را می‌توان در کمتر از ۱ ساعت تکمیل کرد. علاوه بر این، سنجش هایی که نیازی به مراحل شستشو ندارند، به شما امکان می دهد زمان بیشتری را برای تمرکز بر سایر فعالیت های تحقیقاتی انجام دهید. مطمئن شوید که نسبت هزینه به سود را ارزیابی کنید. گاهی اوقات ارزش هزینه اضافی برای صرفه جویی در ساعات یا روزهای کار در دراز مدت را دارد.
-
چه حساسیتی لازم است؟
اگر می‌خواهید از تشخیص آنتی‌ژن‌ها در غلظت‌های پایین اطمینان حاصل کنید، حساسیت سنجش ایمنی مهم است. سنجش‌هایی با دامنه دینامیکی وسیع‌تر برای به دست آوردن اندازه‌گیری‌های دقیق آنتی‌ژن از غلظت‌های بسیار کم تا بسیار بالا و جلوگیری از ناراحتی رقیق‌سازی نمونه‌ها قبل از اندازه‌گیری ایده‌آل هستند.
*سازگاری نمونه به سنجش های فردی بستگی دارد.
