بهبود درمان CAR-T از طریق ایمونوفنوتایپینگ

سلول درمانی به عنوان یک درمان جایگزین امیدوارکننده برای سرطان های هماتولوژیک و جامد در حال ظهور است و درمان CAR-T به عنوان یک راه مهم در حال ظهور است. در این روش، سلول‌های T به طور ژنتیکی با گیرنده‌های آنتی ژن کایمریک (CAR) مهندسی می‌شوند تا توانایی‌های هدف‌گیری خود را افزایش دهند.^1-2. نتیجه درمان با سلول های CAR-T به تعامل پیچیده فنوتیپ، فعال سازی و پروفایل عملکردی این سلول های مهندسی شده بستگی دارد. خصوصیات ایمونوفنوتیپی سلول‌های CAR-T نقش اصلی را در تضمین کیفیت درمان و تسهیل نظارت مستمر بر پاسخ درمان به عهده می‌گیرد.¹. در فرآیند ایمونوفنوتایپینگ، سلول های T مهندسی شده بر اساس نشانگرهایشان جدا می شوند تا ترکیب جمعیت سلولی در نمونه مشخص شود. شناسایی استراتژیک و جداسازی زیرمجموعه های خاص سلول های CAR-T برای افزایش پاسخ های درمانی ضروری است.².

رمزگشایی ترکیب سلولی، تعیین اثربخشی درمان CAR-T

ایمونوفنوتایپینگ یک تکنیک اساسی است که آنتی بادی های خاص را با ترکیبات فلورسنت ترکیب می کند تا بیان پروتئین خاصی را در جمعیت های سلولی برای شناسایی طبقه بندی سلول های نشاندار شده آشکار کند. ایمونوفنوتایپینگ از تفاوت‌های نشانگرهای سطحی بین سلول‌های T استفاده می‌کند و تمایز، فعال‌سازی و حالت حافظه آنها را منعکس می‌کند.². این نشانگرها بینشی در مورد رشد، عملکرد، پتانسیل تکثیر و زنده ماندن طولانی مدت سلول های ایمنی ارائه می دهند. پروفایل های مختلف نشانگر سطحی با اثربخشی سلول درمانی CAR-T ارتباط نزدیکی دارد³. نشانگرهای اصلی برای تجزیه و تحلیل ایمونوفنوتیپی، از جمله CD3، CD4، CD8، CD45RACD34R0، CCR7، CD27و CD95در جدول 1 ارائه شده است.

جدول 1. فنوتیپ جامع نشانگرهای زیرمجموعه سلول T (DOI: 10.1007/978-1-0716-0146-4)

فلوسیتومتری (FCM) روش ارجح برای ارزیابی ایمونوفنوتیپ و عملکرد زیرمجموعه سلول های CAR-T است.⁴. کیفیت آنتی بادی های فلوسیتومتری (FACS) به طور مستقیم بر موفقیت آزمایش ها تأثیر می گذارد. علاوه بر این، FCM نظارت بر سلول‌های CAR-T را در خون بیماران ممکن می‌سازد، که برای پیش‌بینی احتمال و شدت سندرم آزادسازی سیتوکین (CRS) یا سمیت عصبی حیاتی است.⁵.

برای حمایت از تحقیقات ایمونوفنوتایپینگ، Sino Biological مجموعه ای جامع از نشانگرهای زیستی سلول T نوترکیب و همچنین آنتی بادی های FACS مرتبط با سلول T با ویژگی بالا و میل ترکیبی بالا مانند CD3، CD4، CD8 و CD45.

شکل 1. محصولات نشانگر سلول T با کیفیت ارائه شده توسط Sino Biological

انتخاب زیر مجموعه‌های سلول T بهینه‌سازی اثربخشی درمان CAR-T

بهینه سازی اثربخشی درمان CAR-T نیاز به انتخاب از پیش جمعیت سلول های T قبل از مهندسی CAR دارد. از نظر بیان CD، لنفوسیت‌های T را می‌توان بر اساس بیان CD3 ایمونوفنوتیپ کرد، که می‌توان آن‌ها را بیشتر تقسیم کرد، با سلول‌های T CD4+ و CD8+ که با زیرمجموعه‌ها و حافظه و عملکردهای مؤثرشان مشخص می‌شوند که ویژگی‌های متفاوتی را از نظر نشانگرهای بیرونی و درونی، برنامه‌های ژنتیکی نشان می‌دهند. عوامل اپی ژنتیک و مسیرهای متابولیک⁶. این زیرمجموعه ها، ذاتاً به برهمکنش مولکول های CD3 در مسیر سیگنالینگ گیرنده سلول T (TCR) مربوط می شوند، به طور قابل توجهی بر فنوتیپ سلول CAR-T و اثربخشی درمانی تأثیر می گذارند.^5-7. به طور خاص، برخی از مطالعات نشان می‌دهند که سلول‌های CD4+ CAR-T در مقایسه با سلول‌های CD8+ می‌توانند پاسخ‌های ضد توموری قوی‌تری را علیه تومورهای جامد خاص القا کنند.⁸.

شکل 2. نمای کلی شماتیک زیر مجموعه های سلول T https://doi.org/10.1111/all.15104

از نظر فاز فعال سازی، سلول های T ساده و حافظه دار، با ماندگاری طولانی مدت و فعالیت ضد توموری افزایش یافته، در پتانسیل درمانی از سلول های T موثر پیشی می گیرند.⁹. سلول‌های CAR-T یک فنوتیپ حافظه‌مانند را نشان می‌دهند که با نشانگرهای سطحی مانند CD62LCCR7، CD45RA و CD45ROکارایی برتر را نشان دهد³. در مقابل، فنوتیپ های شبه خستگی که با بیان گیرنده مهاری مشخص می شوند (PD-1، TEAM-3، LAG3، CTLA4و TIGIT) اثر درمانی محدودی را نشان می دهد^3.10. محصولات سلول CAR-T مشتق شده از سلول های T از پیش انتخاب شده ساده / حافظه بنیادی (TN/SCM) افزایش پتانسیل گسترش و کاهش خطر CRS را نشان می دهند.¹¹.

آشکار کردن حالت‌های فعال‌سازی و فرسودگی، تضمین اثربخشی درمان CAR-T

فعال‌سازی سلول‌های T مرحله‌ای حیاتی در تولید سلول‌های CAR-T است که بر راندمان انتقال، سرعت گسترش سلول و تمایز تأثیر می‌گذارد. بیان گیرنده سطحی، از جمله CD69، CD71، CD25و MHC-II، به اندازه گیری فازهای فعال سازی سلول T کمک می کند¹². مولکول های محرک مشترک مانند CD26، CD27، CD28، CD30، CD154یا CD40L نیز ممکن است پس از فعال سازی بیان شود¹³. سلول‌های T فعال می‌توانند به دلیل آزاد شدن سایتوکین‌های التهابی مانند TNF-α و IFN-γ^14-15. نظارت بر این سطوح سیتوکین، کارایی جمعیت سلول های T را تضمین می کند (شکل 3). تنظیم دوز تحریک سلول های T بر عملکرد سلول های CAR-T تأثیر می گذارد و منجر به یک محصول درمانی سازگارتر و قوی تر می شود.^16-17.

شکل 3. فنوتیپ‌های مختلف سلول T برای بیان 3 نشانگر فعال‌سازی نمایه می‌شوند: CD69 (اوایل)، CD25 (تأخر) و HLA-DR (حتی بعد). دو سیتوکین موثر (IFNγ و TNFα) نیز با استفاده از ساندویچ الایزا اندازه گیری شدند.

تخلیه سلولی عملکرد سلول های CAR-T را با به حداقل رساندن ماندگاری و فعالیت کشتن آنها تنظیم می کند و در نتیجه پتانسیل درمانی CAR-T در تومورهای جامد را کاهش می دهد. نشانگرهای خستگی مانند PD-1، TIM-3، LAG3، CTLA4 و TIGIT بینشی از وضعیت خستگی سلول‌های CAR-T ارائه می‌کنند و نیاز به استفاده اولیه از سلول‌های T را برای جلوگیری از محدودیت‌های مرتبط با خستگی نشان می‌دهند.¹⁸.

علاوه بر این، انتخاب کوکتل های سیتوکین مختلف یا سیتوکین های مناسب برای کشت سلول های CAR-T می تواند به طور قابل توجهی کارایی سلول های CAR-T را افزایش دهد. Sino Biological با موفقیت طیف وسیعی از سیتوکین‌های با کیفیت GMP و همچنین کیت‌های ELISA را برای تشخیص و اندازه‌گیری سیتوکین‌های باقیمانده تولید کرده است. Sino Biological همچنین پانلی از نشانگرهای کاهش پروتئین نوترکیب را با خلوص بالا و زیست فعالی بالا ارائه می دهد.

شکل 4. کیت های سیتوکین و الایزا با کیفیت بالا

پشتیبانی از Sino Biological برای درمان CAR-T و ایمونوفنوتایپینگ

ایمونوفنوتایپینگ نویدبخش بهبود درمان سلولی CAR-T با بهبود اثربخشی درمانی و پیش‌بینی پاسخ‌های درمانی است. Sino Biological به‌عنوان یک تامین‌کننده جهانی بیورآجنت‌ها و خدمات CRO، راه‌حل‌های کاملی را برای درمان با سلول‌های CAR-T ارائه می‌کند. این راه حل ها شامل معرف ها و خدماتی است که مشتریان را در هر مرحله از کشف اولیه هدف تا مرحله پیش بالینی تحقیق و توسعه پشتیبانی می کند.

Sino Biological طیف وسیعی از معرف ها را برای توسعه سلول درمانی CAR-T ارائه می دهد که شامل بیش از 250 می شود. پروتئین های هدف CAR-T، آنتی بادی برای فلوسیتومتری، کلاس GMP سیتوکین هاو سوپرنوکلئاز درجه GMP. اقدامات کنترل کیفیت سختگیرانه برای اطمینان از کارایی و ایمنی محصولات سلولی CAR-T، از جمله ارزیابی زنده ماندن سلول، پروفایل جمعیت، تشخیص CAR و سمیت سلولی استفاده می شود.

شکل 5. راه حل های کامل برای درمان های CAR-T ارائه شده توسط Sino Biological

منابع

1. Majzner، RG و Mackall، CL (2019). درس های بالینی از اولین مرحله از سفر CAR T cell. طب طبیعی، 25(9)، 1341-1355. https://doi.org/10.1038/s41591-019-0564-6
2. سلول های T گیرنده آنتی ژن کایمریک. Springer Science+Business Media, 2020. doi: 10.1007/978-1-0716-0146-4.
3. Si, X., Xiao, L., Brown, CE, & Wang, D. (2022). ارزیابی پیش بالینی عملکرد سلول T CAR: مدل‌های In vitro و In Vivo. مجله بین المللی علوم مولکولی، 23 (6)، 3154. https://doi.org/10.3390/ijms23063154
4. یو. بلاش و همکاران، “آزمایش‌های فلوسیتومتری پیشرفته برای پایش ایمنی کاربردهای سلول‌های CAR-T،” مرزها در ایمونولوژی، جلد 12 مه 2021، doi: 10.3389/fimmu.2021.658314.
5. Demaret, J., Varlet, P., Trauet, J., Beauvais, D., Grossemy, A., Hégo, F., Yakoub-Agha, I., & Labalette, M. (2021). نظارت بر سلول T CAR با استفاده از فلوسیتومتری. سیتومتری. قسمت B، سیتومتری بالینی، 100 (2)، 218-224. https://doi.org/10.1002/cyto.b.21941
6. Golubovskaya، V.، & Wu، L. (2016). زیر مجموعه های مختلف سلول های T، حافظه، عملکردهای موثر و ایمونوتراپی CAR-T. سرطان ها، 8 (3)، 36. https://doi.org/10.3390/cancers8030036
7. ME Call و KW Wucherpfennig، “مکانیسم‌های مولکولی برای مونتاژ کمپلکس گیرنده سلول T-CD3،” ایمونولوژی مولکولی، جلد 40، شماره 18، ص 1295-1305، آوریل 2004، doi: 10.1016/j.molimm.2003.11.017.
8. D. Kravtsov، A. K. Erbe، P. M. Sondel، و A. L. Rakhmilevich، “نقش سلول های CD4 + T به عنوان واسطه های ایمنی ضد تومور،” مرزها در ایمونولوژی، جلد 13 سپتامبر 2022، doi: 10.3389/fimmu.2022.972021.
9. López-Cantillo، G.، Urueña، C.، Camacho، BA، و Ramírez-Segura، C. (2022). اثربخشی سلول های CAR-T: چگونه می توان ماندگاری آنها را بهبود بخشید؟ مرزها در ایمونولوژی، 13، 878209. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.878209
10. CRF Silveira و همکاران، “سیتوکین ها به عنوان یک بازیگر مهم در زمینه درمان با سلول های CAR-T برای سرطان: نقش آنها در تعدیل ایمنی تومور، تولید و پیامدهای بالینی.” مرزها در ایمونولوژی، جلد 13 سپتامبر 2022، doi: 10.3389/fimmu.2022.947648.
11. S. Arcangeli و همکاران، “تولید سلول های CAR T از لنفوسیت های T حافظه ساده / ساقه، پاسخ های ضد توموری را بهبود می بخشد و در عین حال سندرم آزادسازی سیتوکین را محدود می کند.” مجله تحقیقات بالینی، جلد 132، شماره 12 ژوئن 2022، doi: 10.1172/jci150807.
12. MM نقی زاده، N. حاتم زاده، FG Larsen، RB Kjærup، E. Wattrang و TS Dalgaard، “سینتیک بیان نشانگر فعال سازی به دنبال تحریک پلی کلونال آزمایشگاهی سلول های T محیطی مرغ،” سیتومتری، بخش A، جلد 101، شماره 1، صفحات 45-56، ژانویه 2021، doi: 10.1002/cyto.a.24304.
13. M. Shipkova و E. Wieland، “مارکرهای سطحی فعال سازی لنفوسیت و نشانگرهای تکثیر سلولی،” Clinica Chimica Acta، جلد 413، شماره 17-18، صفحات 1338-1349، سپتامبر 2012، doi: 10.1016/j.cca.2011.11.006.
14. ME Martinez-Sanchez، L. Huerta، ER Alvarez-Buylla، و CV Lujan، “نقش ترکیبات سیتوکین در تمایز سلول های CD4 + T، قطبش جزئی و پلاستیسیته: رویکرد مدل سازی شبکه پیوسته” مرزها در فیزیولوژی، جلد 9 آگوست 2018، doi: 10.3389/fphys.2018.00877.
15. J. Zhu و WE Paul، “سلول های CD4 T: سرنوشت ها، عملکردها، و خطاها”، خون، جلد. 112، شماره 5، صفحات 1557-1569، سپتامبر 2008، doi: 10.1182/blood-2008-05-078154.
16. ی. لی، et. پاراگراف، “مدولاسیون سمیت شبیه به سندرم آزادسازی سیتوکین با واسطه سلول CAR T با استفاده از آداپتورهای با وزن مولکولی کم.” ارتباطات طبیعت، جلد 10 عدد 1، ژوئن 2019، doi: 10.1038/s41467-019-10565-7.
17. N. Lapteva و همکاران، “تحریک گیرنده سلول T گسترش و عملکرد سلول های T بیان کننده گیرنده آنتی ژن کایمریک CD19 را افزایش می دهد.” تحقیقات بالینی سرطان، جلد 25، شماره 24، صفحات 7340–7350، دسامبر 2019، doi: 10.1158/1078-0432.ccr-18-3199.
18. Kouro، T.، Himuro، H. & Sasada، T. کاهش سلول های CAR T: علل و راه حل های بالقوه. J Transl Med 20, 239 (2022). https://doi.org/10.1186/s12967-022-03442-3